【前言背景】
出于多种原因，聚合物水凝胶非常适合组织工程和其他生物医学应用，包括它们为细胞提供的水合环境及其可调节的理化性质。这些水凝胶中使用的合成聚合物包括热敏性聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）（在高于其较低的临界溶液温度时会发生物理胶凝），以及聚乙二醇（PEG）和各种其他聚醚，聚酯的衍生物。这些聚合物可以交联形成高度组织化的网络，该网络因吸水而膨胀以填充组织缺损部位并为细胞提供支架。化学交联对于维持形成后水凝胶的完整性是必不可少的，而热响应性聚合物（例如PNIPAAm）必须经常进行交联以防止水凝胶因被称为脱水收缩的链压缩而崩溃。此外，尽管已经为组织工程开发了许多水凝胶和合成交联剂，但是这些系统在很大程度上是生物惰性的，因此需要进一步修饰以产生组织特异性生物活性，这是发展所需组织表型的关键前提。
引入水凝胶生物活性的方法包括递送组织特异性生长因子和肽，以及使用生物活性大分子（如糖胺聚糖）作为水凝胶材料。例如，组织特异性生长因子（例如来自转化生长因子-β超家族的那些）通常通过从中间血管（例如明胶微粒）中受控释放来传递，以促进骨骼和软骨的再生。或者，可以将这些组织特异性生物分子直接与水凝胶偶联，以产生生物活性线索的原位呈递，并降低生物分子扩散引起的异位效应的风险。
【科研摘要】
合成水凝胶因其可调节的理化特性而在组织工程中进行了广泛研究，但具有生物惰性，并且缺乏产生适当生物学反应的组织特异性线索。为了向这些水凝胶引入组织特异性的生化线索，莱斯大学Antonios G. Mikos教授团队开发了一种模块化水凝胶交联剂，poly(glycolic acid)–poly(ethylene glycol)–poly(glycolic
acid)-di(but-2-yne-1,4-dithiol)（PdBT），只需在室温下将PdBT与适当的生物分子在水中混合，就可以用基于小肽的线索和大分子线索进行功能化。软骨和骨特异性PdBT大分子单体是通过与软骨相关的疏水性N-钙粘蛋白肽，亲水性骨形态发生蛋白肽和软骨衍生的糖胺聚糖，硫酸软骨素进行功能化而生成的。这些生物功能化的PdBT大分子单体可以自发地交联聚合物，例如聚（N-异丙基丙烯酰胺），以生产适用于间充质干细胞封装的快速交联，高度溶胀，细胞相容性和可水解降解的水凝胶。这些优越的性能，再加上PdBT的模块化设计和易于功能化，为其在组织工程应用中的使用奠定了强大的潜力。相关论文Modular,
tissue-specific, and biodegradable hydrogel cross-linkers for tissue engineering发表在科学杂志《Science Advances》上。
水凝胶交联剂的合成与表征
作者开发了一种新颖的名为PdBT的水凝胶交联剂，可用于组织特异性提示的功能化。PdBT具有模块化组件，包括用于生物共轭的炔烃部分，用于交联的正交巯基末端和用于水解降解的可调聚酯嵌段（图1）。
图1：用于组织特异性生物分子的点击结合的模块化水凝胶交联剂。
使用可商购的试剂通过三嵌段PGA-PEG-PGA上羟基末端的甲磺酸酯活化来合成PdBT，然后使用but-2-yne-1,4-dithiol对甲磺酸酯基进行亲核取代（图2A）。我们使用1H核磁共振（NMR）确认了PdBT的预期化学结构（图3），并通过与图1中的起始原料的1H和13C NMR光谱相关联进一步确认。作者首先通过根据中心PEG链上预期的质子数将左峰“d”设置为89.27H来校准1H
NMR峰积分（图3）。峰“a”代表赋予水解降解性的PGA重复单元，峰积分显示每条PdBT链平均〜7.57个PGA单元，大致相当于单体进料比预期的8个PGA单元。根据峰“a”至“g”的NMR分析，PdBT的分子量约为1562 Da，凝胶渗透色谱（GPC）表征显示的近似数均分子量（Mn）值为1381±74 Da，多分散指数（PDI）为1.09±0.03（n = 3）。峰“ e”和“
f”代表末端炔烃部分上的质子，充当每个PdBT链一个或两个生物分子的点击缀合的位点。峰“ g”对应于用于亲核性交联反应的末端巯基。在本文描述的模型水凝胶系统中，使用自发硫醇-环氧反应通过PdBT交联P（NIPAAm-co-GMA）（图2）。
图2交联的生物功能化水凝胶的产生。
图3使用1 H NMR确认PdBT结构。
单击功能化的PdBT
接下来，通过在水中进行便捷的混合过程，使用具有不同大小和亲水性的几种特定于骨骼和软骨的生物分子，对PdBT进行了生物功能化。PdBT可通过亲水性骨形态发生蛋白模拟物（BMPm）肽，参与软骨形成的疏水性N-钙黏着蛋白（NC）肽或软骨衍生的糖胺聚糖大分子硫酸软骨素（CS）进行功能化。通过已建立的固相肽合成程序合成了具有叠氮化物官能化N末端的BMPm和NC肽，而CS则如前所述用叠氮化物部分进行了修饰。PdBT的所有生物功能化反应均在环境温度下进行，并在0.1摩尔当量（eq。）Cp
* Ru（cod）Cl的存在下，将目标生物分子与PdBT以2：1摩尔比混合8小时进行和4摩尔当量二硫苏糖醇（DTT）分别用于催化和二硫键抑制（图2B）。然后，通过在H2O中透析24小时来去除杂质和未反应的试剂。CS/PdBT的合成产率非常高，为87.1％，而BMPm/PdBT和NC/PdBT的合成产率分别为65.0和58.7％。
通过比较相对于内标的反应前后叠氮化物相邻1H NMR峰的峰大小来量化叠氮化物基团的转化，表明CS/PdBT的转化率为83.3％，BMPm的转化率为82.1％，NC/PdBT的转化率为89.7％（图4，A至C）。因此，所有生物分子的高转化率都与该反应的点击性质相符。
图4 CS，BMPm和NC生物分子与PdBT的点击偶联。
与结合PdBT的生物分子相比，GPC用来表征未结合的生物分子的分子量分布，并且在所有三种生物分子的点击缀合后，Mn均增加（图4D）。例如，CS和CS/PdBT在点击共轭后显示出Mn的统计学显着增加，从23.5±2.0增加到38.1±3.3
kDa，这对应于两条CS链与单个PdBT大分子单体的结合所产生的CS链延长（图2B）。类似地，BMPm和NC肽在缀合后显示出Mn和PDI的统计学显着增加，这与通过将两种肽附着到每个PdBT大分子单体上产生的预期分子量增加大致一致（图4D）。因此，1 H NMR和GPC数据表明PdBT可以与亲水和疏水肽以及大型生物大分子缀合，为具有化学和物理性质的生物分子的生物缀合建立了概念验证。
生物功能化PdBT的水凝胶交联
接下来，建立了PdBT，CS/PdBT，BMPm/PdBT和NC/PdBT作为功能性10％（w/v）P（NIPAAm-co-GMA）水凝胶系统的水凝胶交联剂（图2C）。如果将PNIPAAm基凝胶化学交联，则将其放入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中时会因吸水而膨胀，但如果交联不足，则会通过脱水收缩压实并排出水团，这使该水凝胶系统成为一种简便的模型用于评估PdBT和生物功能化的PdBT大分子单体作为水凝胶交联剂的性能。因此，本研究的目的是确定与水凝胶形成时的初始溶胀率相比，在平衡时产生更大溶胀率的PdBT，CS/PdBT，BMPm/PdBT和NC/PdBT浓度。高度溶胀，高度交联的水凝胶。对于这项研究，测试了每个交联大分子单体的最大可溶浓度，以及在PBS（pH
7.4）中以1：3和2：3的稀释度（图5A）。3.5％（w/v）PdBT，4.66％（w/v）CS/PdBT，10.5％（w/v）BMPm/PdBT和3.5％（w/v）NC/PdBT或更高的浓度具有统计学意义变形后膨胀的程度（图5A），代表了良好交联的系统。因此，将用于形成良好交联体系的最低浓度用于所有进一步的水凝胶表征。如硫醇-环氧交联反应产生的热释放的差示扫描量热法所显示，所有四个水凝胶交联反应均在约60分钟内完成（图5B），表明生物分子共轭并未明显干扰PdBT的快速反应。交联动力学。
图5 PdBT交联水凝胶的溶胀，反应动力学，水解降解和细胞相容性。
参考文献：
DOI: 10.1126/sciadv.aaw7396
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