【介绍】
三维（3D）生物打印是一种新兴技术，目前正在引起人们的广泛关注，它具有革新组织工程和再生医学领域的潜力。已经研究了不同的天然生物墨水在3D生物打印中的潜在应用，例如明胶，胶原蛋白和透明质酸，所有这些都是从非人类来源获得的。这些天然材料具有比合成聚合物墨水更好的生物相容性，因为它们具有固有的生物功能对细胞附着和生长必不可少的线索。然而，由于它们的机械强度弱并且不能保持良好的形状保真度，因此这些生物油墨通常用丙烯酸酯基团化学修饰以诱导使用紫外线的聚合。
在打印过程中长时间累积的紫外线暴露以及光引发剂的存在会极大地降低这些生物墨水的生物相容性。此外，将这些生物墨水用于临床还存在其他一些问题，例如批次之间的差异和免疫原性。对苛刻的溶剂（例如DMSO）和非生理pH的需求限制了合成的超分子水凝胶作为生物墨水的使用。基于二苯丙氨酸的肽水凝胶也可用作生物墨水，在这种情况下原位凝胶化无需任何化学交联，但支架的过夜老化和打印后添加细胞对将其用作生物墨水构成了挑战。
【科研摘要】
阿卜杜拉国王科技大学Charlotte A. E. Hauser教授团队报告了合理设计的超短肽生物墨水，克服了当前生物打印程序中的严重限制。由于生物打印能够通过自动沉积工艺制造复杂的组织支架，因此生物打印在组织工程，再生医学和个性化医学中越来越重要。打印具有高形状保真度的稳定的大规模构建体并能够长期保持细胞存活是大多数现有生物墨水无法解决的主要挑战。
另外，它们需要化学或紫外线交联来进行结构固化过程，这会损害被包封的细胞，从而导致结构复杂性受到限制，细胞活力降低。使用超短肽生物墨水作为理想的体状但合成的材料，我们证明了通过在真实的生理条件下和具有成本效益的低生物墨水浓度下进行复杂的挤出程序，可以立即固化细胞嵌入的打印过程。作者打印的大规模细胞构建体和打印的间充质干细胞的软骨分化表明，肽生物墨水具有用于自动化复杂组织制造的强大潜力。相关论文以题为Ultrashort
Peptide Bioinks Support Automated Printing of Large-Scale Constructs Assuring Long-Term Survival of Printed Tissue Constructs发表在《Nano Letters》上。
【图文解析】
合理设计的超短自组装肽是一类有前途的生物材料，可解决与天然生物墨水有关的许多局限性。这些两亲性肽由3-7个氨基酸组成。它们在生理条件下自组装，由与细胞外基质内的纤维极为相似的纳米纤维形成水凝胶。这些特性使超短肽成为组织工程和再生医学应用的合适生物材料。
受早期报道的四肽的有前途的生物打印特性的影响，我们合理设计了新颖的芳香族和非芳香族四肽两亲物：Ac-Ile-Ile-Phe-Lys-NH2（IIFK），Ac-Ile-Ile-Cha-Lys-NH2（IIZK），和Ac-Ile-Cha-Cha-Lys-NH2（IZZK）作为潜在的生物打印应用生物墨水（图1A）。通过HPLC-HR-MS确认其纯度和质量。我们观察到，所有三种肽均能够在1x
PBS中以0.1％w / v（1 mg / mL）形成透明水凝胶，其中IIZK的水含量高且胶凝时间最短为7分钟。值得注意的是，它们的最低胶凝浓度（MGCs）是生理条件下非酶超分子水凝胶的最低胶凝浓度之一。这些初步发现表明，这三种肽有望成为有前途的生物墨水候选物。
图1.自组装的两亲超短肽的结构特征。（A）单个三个四肽的化学结构。（B）IIFK（左），IIZK（中）和IZZK（右）的拉曼光谱。（C）IIFK（左），IIZK（中）和IZZK（右）凝胶的SEM显微照片。（D）顶行：IIFK（左），IIZK（中）和IZZK（右）的纤维的AFM形貌。中排：一部分光纤的AFM地形为I；下排：中间行图像的振幅AFM信号具有阴影效果，可增强周期性的可见性。
为了进一步分析自组装过程，在水中进行了分子动力学（MD）模拟。对于每个肽，进行2、4和60个肽的组装。所有这三种肽的模拟数据均证实了较早提出的自组装逐步机理，从反平行对的形成，匝状二级结构的形成开始，最后缩合为长而稳定的纤维（图2A）。所有肽水凝胶的机械刚度由储能模量（G'）决定（图2B）。作者观察到，与含Phe的肽相比，含Cha的肽的G'值（刚度）更高。IZZK水凝胶的机械刚度在21.45
mM（13 mg/mL）时增加至300.0 kPa，即明显高于早期报道的肽水凝胶。作者假设IZZK的高刚度是由于Cha-Cha跨链相互作用。所有三种肽水凝胶的粘度也在0.4-0.6 Pa·s的范围内，适用于挤出生物打印机（图2C）。
图2.两亲四肽的结构和机械表征。（A）水中的四肽IIFK，IIZK和IZZK的分子动力学（MD）模拟，显示了60个在100 ns组装的肽的原纤维结构。（B）在0.1％应变和1 rad/s角频率的时间扫描测量5分钟后，以不同浓度的IIFK，IIZK和IZZK水凝胶在PBS缓冲液（n = 6）中的储能模量。（C）13
mg/mL肽原液的粘度与剪切速率的关系。将PBS溶液添加到各个肽溶液中后即直接进行测量，即1 mg/mL的IIFK（1.78 mM），IIZK（1.76 mM）和IZZK（1.65 mM）。
为了进一步检查细胞相容性，在3D培养物中评估人骨髓间充质干细胞（BM-MSC）和人皮肤成纤维细胞（hDFn）（图3A）显示出强大的细胞活力和高达14天的高增殖率，优于2D和Matrigel文化（图3A，B）。持续的细胞表面标志物表达和三系分化证明在3D培养物中细胞特性没有受到损害。为了充当有效的3D细胞生长基质，水凝胶支架必须支持细胞基质相互作用以及细胞侵袭或迁移。与在普通表面（2D）上进行细胞迁移相比，在3D矩阵内进行细胞迁移是一个更为复杂的过程。大多数合成水凝胶需要具有特定提示的功能化，例如基质金属蛋白酶，MMP，降解位点和整联蛋白结合域，以促进细胞迁移和侵袭。我们观察到在不包含任何其他功能的肽水凝胶中培养的人BM-MSC的细胞-基质相互作用和持续迁移能力（图3A
c，d）。在3D培养期间，BM-MSC保持其长双极性形态，并发现其从血纤蛋白凝块中迁移出来，并侵入周围的肽水凝胶（图3A d）。
图3.在IIFK（在MGC处为G'14.45±1.37 kPa）和IIZK（在MGC处为G'6.52±0.18
kPa）肽水凝胶中培养的人骨髓间充质干细胞（hBM-MSC）和原代小鼠皮质神经元的生物相容性和形态。（Aa，Ba）用钙黄绿素-AM（绿色，活细胞）和乙锭homodimer-1（红色，死细胞）染色的细胞的活/死细胞活力测定。（Ab，Bb）与基质胶和2D培养物或聚d-赖氨酸（PDL）2D培养物相比的细胞增殖评估。（Ac）细胞核和细胞骨架蛋白F-肌动蛋白的免疫荧光染色。（F-肌动蛋白，红色；核，蓝色）。（Ad）使用血纤蛋白滴测定法评估细胞迁移。（Bc）用神经元特异性小鼠抗β-III微管蛋白（TUJ1）抗体标记的小鼠皮质神经元（绿色），并用DAPI复染（蓝色）。（Bd）关于突突数量，长度和生长的TUJ1阳性神经元分析。比例尺对应于50μm。
作者进一步证明了该肽生物材料作为适用于其他细胞系统的3D支架的功效和潜力。在3D肽水凝胶中培养小鼠原代皮层神经元，并针对聚d-赖氨酸（PDL）涂覆的2D培养物评估细胞生长和细胞特性。我们的数据清楚地表明，肽水凝胶支持活力并促进初级神经元的成熟和神经突的生长（图3B a–d）。与PDL相比，观察到IIZK和IIFK水凝胶中培养的细胞的神经突长度和神经元分支数量显着增加（图3B d）。
细胞相容性，在良好的生理条件下即时凝胶化以及可调节的机械性能，促使我们测试超短肽作为可打印生物墨水。 使用我们内部开发的机械手臂3D生物打印机对打印性进行了测试，该机器进一步通过双同轴挤出喷嘴进行了优化（图4A）
图4.三维生物打印系统和可打印性评估。（A）三维生物打印系统，包括机器人3D生物打印机，微流体泵和新开发的双同轴喷嘴。（B）使用肽IIFK（a），IIZK（b）和IZZK溶液（c）的打印空心圆柱构造。使用肽IZZK（d）打印的人样鼻子构建体。比较第1天（e）和第30天（f）打印构造物稳定性的代表性图像。（C）使用细丝塌陷测试的IIZK和IZZK肽生物墨水的形状保真度。IIZK生物墨水纤维保持一条直线，在16毫米的间隙处仅略微下垂。（C
b）IZZK生物墨水纤维在整个结构上保持一条直线，没有下垂的迹象，包括更长的间隙。
图5.使用IIFK，IIZK和IZZK肽生物墨水对两种不同细胞类型进行三维生物打印。（A）hBM-MSC在打印结构中的形态和3D分布。（B）使用IIFK和IIZK肽溶液（24天）培养时间对hDFn细胞印后的活/死长期细胞生存力评估。（C）打印的IIZK的SEM图像（比例尺，4μm）显示纤维的排列。（D）培养10天后的打印hBM-MSC的SEM和TEM图像，清楚表明健康细胞嵌入3D打印纳米纤维支架中。（e，f）分别在IIZK，比例尺1和2μm处打印的hBM-MSC的TEM图像，显示带有完整肌动蛋白纤维，线粒体，内质网甚至在具有分裂核的细胞上的打印细胞的健康状态。（E）使用IZZK肽溶液对3D打印的hBM-MSC构建体进行软骨分化。（F）（a）证明了hBM-MSC软骨分化后的构建体弹性。（b）与未分化的hBM-MSC相比，COL2A1，COL10A1和ACNA基因在分化的打印hBM-MSC中的相对表达。
随后，通过打印不同的充满细胞的3D构建体，研究了新开发的肽生物墨水的生物可打印性。立即进行印后，观察到均匀的细胞分布，表明我们的喷嘴设计在将细胞与生物墨水混合中的功效。通过活/死分析在多天中观察到细胞的活力。在第0天，观察到高百分比的细胞活力（>
90％），并在24天的观察期内得以保留（图5A，B）。这种维持的细胞存活率比其他生物墨水（例如GelMA，藻酸盐/纳米纤维素和κCA-纳米硅酸盐）更好或可比。
参考文献：
doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c04426
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