【科研摘要】
酶是自然界的催化剂，在利用可再生资源进行可持续生产方面具有巨大潜力。使酶适应工业过程的要求是在合成精细化学品，食品和药品的大规模转化中利用其益处的先决条件。使用天然和合成载体固定野生型或工程化酶已广泛用于改善催化性能，确保回收和再利用，从而促进其在工业过程中的使用。在过去的三十年中，固定化酶的设计和应用取得了重大进展。作为凝胶固定蛋白的容器，微凝胶正逐渐成为一种有前途的替代品，这反映在越来越多的文献中，这些文献证明了它们在可持续催化过程中的使用。微凝胶是交联的亚微米级胶体聚合物网络，最近德国亚琛工业大学Ulrich
SchwanebergIslam， El-Awaad和Andrij Pich教授团队在《Green Chemistry》上发表题为Biocatalytic microgels (μ-Gelzymes): synthesis, concepts, and emerging
applications的综述，他们总结了微凝胶酶（μ-Gelzymes）的合成和应用进展。首先探索在微凝胶上或之内用于酶固定的不同方法，并给出在不同应用中使用μ-半酶的代表性实例。随后，从绿色化学的角度讨论了μ-半酶在实现可持续催化方面的潜力。最后，为进一步改进生物催化μ-半胱氨酸酶（作为交互式软物质的跨学科研究领域）绘制了未来的方向。
【图文解析】
酶的固定化可以通过物理吸附，捕获或共价结合来实现。选择合适的固定化策略和载体材料对于固定化酶的适当性能至关重要。在设计固定策略时，应考虑在活动性和稳定性之间进行权衡。例如，物理吸附通常保持所需的柔韧性以保持酶活性。然而，通常通过沥滤发生酶负载的逐渐损失。
纳米和亚微米尺寸的聚合物材料作为各种货物的合适载体已引起关注。在这类材料中，微凝胶作为“智能”载体已经引起了人们的特别兴趣，这些载体可以设计为对外部刺激作出反应。微凝胶是多孔的，高分子量的胶体聚合物网络，其尺寸范围从纳米到微米（在本综述中，作者将尺寸与微凝胶无关）。它们通过结合硬质颗粒，大分子和表面活性剂的性质来结合胶体领域的多样性。微凝胶具有各种有利的特性，包括可调节的结构，高孔隙率以及可调节的溶胀度和尺寸。它们的大表面积，出色的胶体稳定性，易于合成和后修饰催生了广泛的应用。例如，微凝胶已用于防污涂料，药物和基因传递，生物传感，组织工程，水净化和植物叶面施肥。关于微凝胶合成，物理特性和应用的各个方面已在数篇优秀的评论中进行了讨论。微凝胶由于其化学和机械稳定性，生物相容性，孔隙率以及实现高酶负载的能力而成为理想的酶载体。而且，通过连续聚合过程，微凝胶合成可大规模扩展。此外，通过改变它们的组成，可以获得响应于外部刺激例如温度，pH，离子强度和溶剂性质而改变其几何形状和亲水性/亲脂性的刺激响应性微凝胶。在溶胀状态下，它们柔软而模糊的表面导致溶剂和溶质分子的高迁移率，从而减少了扩散限制。在塌陷状态下，微凝胶通常表现为胶体颗粒，这有助于它们从反应混合物中受控地除去。此外，处于溶胀状态的微凝胶的高水分含量（>
99％）为酶提供了一种水性的，因此是天然的微环境，可以保护它们免受有机介质的侵害。
因此，微凝胶是酶固定的通用平台。在这篇综述中，组织探索了微凝胶中不同的酶固定方法以产生μ-凝胶酶，并根据酶负载的方法对其进行了分类（图1）。后者包括（1）酶与预合成的微凝胶的共价结合，（2）伴随的微凝胶合成和酶固定，以及（3）利用微凝胶的刺激响应性来固定和控制酶的反应性。组织将在专门的部分中讨论每种方法，并重点介绍一些示例，其中μ-Gelzymes已在应用中找到了自己的方法，它们是未来开发的垫脚石。就μ-Gelzyme催化反应的范围，优势和局限性进行了批判性的讨论，并分析了它们在大规模过程中实现绿色化学的潜力。最后，提出了一种整合方法，通过计算模型将蛋白质工程和微凝胶设计相结合，以进一步发展该领域。
图1在本综述范围内讨论的μ-半乳糖酶概述，根据用于酶上样的方法分为三部分。
2.将酶共价固定在预先合成的微凝胶上
通过在酶表面和微凝胶网络中的反应性基团之间形成共价键，可以将酶固定在预合成的微凝胶中。
2.1使用未修饰的酶进行共价固定
通过在微凝胶中包含羧酸和伯胺官能团，无需进一步修饰酶即可将酶直接共价固定在微凝胶中。引入微凝胶后，可以通过与碳二亚胺反应获得活化的胺反应性酯（图2a）或戊二醛进行修饰，以使其随后与酶的胺官能团偶联（图2b）。
图2.在微凝胶中固定共价酶的策略。
2.2 酶修饰后的共价固定
作者概述了用于共价固定而不修饰或激活酶的策略。但是，也可以在固定化之前修饰酶的反应基团，从而可以在温和的反应条件下轻松地修饰赖氨酸残基的伯胺官能团以及天冬氨酸和谷氨酸的羧酸官能团（图2）。这种策略允许对附着点的数量和位置进行更多控制，以实现针对特定地点的固定。
最近，Zou等人将分选酶介导的微凝胶功能化进一步迈进了一步，并固定了五种不同的带有GGG标签的酶（枯草芽孢杆菌脂肪酶A（BSLA），鼠疫耶尔森菌植酸酶（Ym-植酸酶），大肠杆菌铜外排氧化酶（CueO漆酶），纤维素酶（CelA2_M2）和巨大芽孢杆菌单加氧酶P450 BM3）。酶用N末端GGG标签修饰。CueO漆酶和P450 BM3 M2单加氧酶也配有C端LPXTG分选基序（图3）。
图3使用分选法将酶固定在微凝胶（μ-Gelzymes）上的位点特异性固定。
3.微凝胶合成过程中的酶固定化
将酶固定在微凝胶中的广泛研究的方法是在微凝胶合成过程中的包封或束缚（即原位固定）。 根据酶被包埋的步骤，已开发出两种不同的策略。
3.1 聚合过程中通过封装固定化
通过沉淀聚合的微凝胶合成涉及（共）单体和交联剂的直接聚合。通常在沉淀聚合中，在高温（> 50°C）下使用热引发剂引发自由基的形成，并在高于其较低的临界溶液温度（LCST）的条件下诱导形成的聚合物链塌陷，从而形成微凝胶核。通过沉淀新形成的聚合物链，微凝胶核进一步生长，并在单体消耗后达到其最大尺寸。
遵循这一想法，Bao等人提出了一种使用反相W/O乳液的交联剂N，N'-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）进行N，N-二甲基丙烯酰胺（DMAA）的酶促聚合的方法（图4）。将包含单体，交联剂以及HRP酶的水相滴加到辛烷相中，该辛烷相包含表面活性剂Tween 20和Span
80以及乙酰丙酮（ACAC）作为自由基介体。加入H2O2后，HRP介导ACAC碳自由基的形成。由于ACAC界面扩散到水相中，可以引发微凝胶的形成。这组作者展示了通过改变BIS的浓度（从而改变微凝胶的平均筛孔大小）可调节的酶活性。但是，这仅在很小的范围内是正确的。BIS超过0.2
wt％时，酶活性急剧下降。在最佳条件下，与未固定化的酶相比，固定化的HRP保留了其全部活性。作者观察到了封装对酶的热稳定性的明显影响：在70°C下孵育30分钟后，固定化的HRP保留了其原始活性的33％，而游离HRP的残留活性为14％。μ-Gelzymes还显示出非常高的储存稳定性，并在3个月后保留了其原始活性的98％（与新鲜固定的酶相比）。
图4在油包水乳液中DMAA聚合过程中HRP的物理截留。
3.2 反应性聚合物链交联过程中酶的固定化
为了克服在酶存在下沉淀聚合的局限性，引入了两步微凝胶合成方法。最初，线性（共）聚合物链是通过自由基聚合或受控自由基聚合（例如可逆加成-断裂链转移聚合-RAFT）合成的。Wu等人利用了辣根过氧化物酶（HRP）的作用，这种金属酶可以使用过氧化氢（H2O2）催化反相细乳液中酚类树状聚（甘油）衍生物（dPG）的交联（图5）。作者报告称其装载效率为40％，相当于每g微凝胶1.64
mg蛋白质。值得注意的是，没有酶释放的迹象，并且封装的HRP表现出改善的热稳定性。在50°C下孵育42小时后，固定化的HRP保留了其活性的70％（与游离酶相比为10％）。此外，作者证明了不参与微凝胶形成（CalB）的酶的成功共固定化。
图5. HRP催化的微凝胶交联以包裹酶。微凝胶配有通过自由基酚偶联而交联的酚部分。HRP被截留，可用于进一步催化。
蛋白质被认为是其表面上多个官能团的载体，可以充当微凝胶网络中的交联位点。Peng等人使用RAFT聚合来预合成基于甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和环状N-乙烯基酰胺的聚合物，例如N-乙烯基吡咯烷酮（PVPS），N-乙烯基哌啶酮（PVPIS）和N-乙烯基己内酰胺（PVS）。作者旨在将纤维素酶变体（CelA2_M2）封装（和交联）在PVPS微凝胶中，以显示出更高的比活性和对离子液体的抵抗力。通过在存在于酶表面的赖氨酸的胺基和共聚物中的琥珀酰亚胺侧链之间形成一个酰胺键，在油包水乳液中制备生物杂交微凝胶（图6）。
图6.通过反应性聚合物链与酶的交联来包封酶纤维素酶（CelA2_M2）。
4.微凝胶作为可转换酶载体
4.1 可逆的非共价固定化和触发的酶释放
大多数非共价酶固定化策略都集中在酶与微凝胶之间的吸附，超分子，静电或其他（氢键；范德华力）相互作用。
4.1.1刺激响应性微凝胶固定和释放酶
Sigolaeva等人证明了通过静电相互作用将酪氨酸酶（来自蘑菇，含铜的多酚氧化酶）固定在PNIPAAm-N，N-二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺（PNIPAAm-DMAPMA）微凝胶中，用于苯酚生物传感器应用。首先，将微凝胶吸附到导电基质（石墨或金）的薄膜上，而在第二步中，将酪氨酸酶固定在微凝胶中。作者利用pH响应行为来确保酶和微凝胶具有相反的电荷，以实现强烈的静电相互作用。此外，在微凝胶的溶胀和塌陷状态下研究了酶的吸附。有趣的是，当酪氨酸酶以塌陷状态被吸附时，酪氨酸酶的固定效果最好，同时将温度降低到VPTT以下。随后的微凝胶再溶胀导致酶被吸入聚合物网络，例如液体进入海绵。与在膨胀的微凝胶状态下固定酪氨酸酶相比，后者技术将生物传感器的灵敏度提高了3.5倍以上。
基于吸附的酶固定化的另一种引人入胜的策略取决于从极性介质到非极性介质的溶剂交换。 Gawlitza等人通过将大量溶剂首先交换为与水混溶的异丙醇，然后交换为与水不混溶的己烷，将脂肪酶CalB固定在PNIPAAm微凝胶中（图7）。
图7通过从缓冲水溶液到异丙醇再到己烷的两步溶剂交换，将CalB截留到PNIPAAm微凝胶中。
4.1.2可逆的酶固定化和通过微凝胶降解释放除了微凝胶的可切换行为外，可以通过设计可降解的微凝胶网络来实现酶的触发释放。
Peng等人使用RAFT聚合描述了一种使用氧化还原反应系统和降解技术来抑制酶活性的诱人策略。使用RAFT聚合反应制备了吡啶二硫化物官能化的聚（N-乙烯基吡咯烷酮）链（PVP-PDS）。随后的交联是通过添加不同的多功能巯基末端交联剂实现的。在交联步骤中添加了纤维素酶，从而将其封装在微凝胶网络中。有趣的是，该酶已经显示出与线性反应性预聚物的强相互作用，这可以通过赖氨酸残基的质子化氨基与聚合物链的羰基之间的氢键形成来解释。通过交联预组装的纤维素酶-聚合物聚集体，可实现高达77％（15.5
mg g-1共聚物）的酶负载效率。与游离酶相比，固定化微凝胶的纤维素酶的酶活性降低了（占游离酶的4.5–8.8％）。有趣的是，加入二硫苏糖醇（DTT）后可恢复55％的酶活性，该酶裂解了氧化还原反应性的二硫键交联位点，最终导致微凝胶降解和酶释放（图8）。
图8：通过用不同的多官能硫醇端交联剂将反应性预聚物（由吡啶基二硫键官能化的聚（乙烯基吡咯烷酮）交联）进行纤维素酶的物理包埋。
6.1 μ-Gelzyme催化的范围
通常，水解酶（例如纤维素酶，β-gal，脂肪酶）和氧化还原酶（例如HRP，GOx，漆酶）主要用于μ-Gelzyme合成。然而，连接酶（例如Acs），裂解酶（例如DERA）和转移酶（例如Pk）在文献中较少出现。
由μ-半乳糖酶催化的反应大部分是在人工底物（例如ATBS，p-NPP，4-MUC）下进行的。相反，较少报道具有天然或非人工底物的μ-Gelzyme生物转化（使用非人工底物进行的40次固定运动中有13次发生；图9）。此外，由μ-Gelzymes催化的生物转化大多是具有低工业重要性的“模型”反应（图9），这突出表明需要将μ-Gelzymes的范围扩大到具有可持续大规模技术应用潜力的酶。
图9.非人工底物的μ-Gelzyme生物转化概述。
7.从绿色化学角度看μ-半胱氨酸酶
组织讨论了μ-半胱氨酸酶对可持续催化的影响以及它们如何符合绿色化学原理。作为方程式的一部分，酶是可持续催化的关键因素，因为它们在环境友好的反应条件下以令人印象深刻的化学，区域和立体选择性进行（生物）化学反应的能力，已经在许多出版物中进行了介绍和评论。微凝胶，特别是它们作为酶载体的应用，尚未就绿色化学原理进行广泛表征。可以在水相中合成微凝胶（例如，通过沉淀聚合）并在被认为是安全且对环境有益的溶剂的水中施用。
用于微凝胶合成的E因子对溶剂的质量敏感，因为溶剂的质量主导反应物的质量。通过使反应物的初始浓度增加一倍并保持所有其他条件不变，可以将E因子降低至35，但塌陷的微凝胶的流体力学半径从175 nm增大到220
nm，增加了25％（图10）。预期流体动力学微凝胶半径会增加，因为溶剂的减少会导致单体浓度升高，从而导致微凝胶变得更大。由于流体动力学微凝胶半径是微凝胶的关键质量特性，因此这种变化对于应用而言可能是不可接受的。因此，执行了动态优化，类似于先前报告的优化活动。
图10通过动态优化（预测反应物浓度变化和流体动力学微凝胶半径的微凝胶合成机理模型）将PVCL微凝胶合成的E因子最小化，同时将流体动力学微凝胶半径保持在其原始值的5％以内。
8.未来方向：协同酶工程和微凝胶设计
作者之前严格地讨论了μ-半乳糖酶的挑战和局限性，以及它们目前在绿色化学领域中的贡献和制约因素。简而言之，一方面，μ-Gelzyme的催化作用受到缺乏大规模应用和与工业相关的反应的限制，但另一方面，μ-Gelzyme的催化作用受到削弱（例如，μ-Gelzymes的活性和耐用性）。为了提高μ-Gelzyme的性能并使它们在工业应用中更具竞争力，从酶和微凝胶的角度出发，必须以集成的方式进行μ-Gelzyme的工程设计（图11）。
图11协同蛋白工程和微凝胶设计的概念。
参考文献：
doi.org/10.1039/D0GC03229H
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